Science：首次在人类原代T细胞中进行CRISPR激活和抑制筛选，为下一代细胞治疗提供新靶点

作者|汪聪

编辑|王多玉

排版|水上书写

CRISPR-Cas9基因编辑技术利用向导RNA(GRNA)将Cas9酶靶向到靶DNA序列，Cas9酶切割靶DNA双链，导致非同源末端连接修复中的DNA双链断裂,和DNA的错误(NHEJ)，从而实现基因敲除。

斯坦福大学的亓磊和其他人率先开发了dCas9,这是一种突变的Cas9酶。它保留了Cas9与DNA结合的能力，但不会切割双链DNA。通过将dca9与转录激活蛋白结合，它可以激活一个特定的基因，即CRISPRa.通过将DCA 9与转录抑制蛋白结合，可以抑制特定的基因，即CRISPRi,CRISPRa和CRISPRi扩大了CRISPR基因编辑技术的应用范围，为功能基因筛选提供了新的工具。

人类T细胞对抗原刺激的反应，包括细胞因子的产生，对健康的免疫功能至关重要，这种反应可能在自身免疫性疾病、免疫缺陷病和癌症中失去平衡。了解通过功能获得(激活基因表达)或功能丧失(抑制基因表达)来调节T细胞活性的基因，对于免疫相关疾病的治疗和CAR-T等细胞疗法的改进具有重要意义。

CRISPRa和CRISPRi是研究永生化细胞系的功能获得(基因表达的激活)或功能丧失(基因表达的抑制)的有力工具，但在原代细胞.研究这种大规模的基因筛选仍然具有挑战性

最近，加州大学旧金山分校的Alexander Marson和其他人在《Science日报》上发表了一篇题为《人类初级T细胞中Crispr激活和干扰屏解构反应》的研究论文。

这项研究发展了在人类原代T细胞中进行CRISPRa和CRISPRi的基因功能筛选平台.的，并将其应用于T细胞响应刺激的细胞因子产生的功能调节基因的全基因组筛选。

近年来，Alexander Marson一直致力于利用CRISPR-Cas9技术敲除各种人类免疫细胞上的基因，希望找到能够帮助免疫细胞更好地对抗感染、炎症或癌症的基因，从而更好地发展细胞免疫疗法。然而，这种基于CRISPR-Cas9的基因敲除无法确定某些基因增强后会发生什么，于是研究团队开始利用CRISPRa进行相关研究。

研究团队优化了基于慢病毒的递送方法，使CRISPRa成分可以高效、可扩展地递送至原代人T细胞。然后，利用该平台进行全基因组CRISPR筛选，发现T细胞中细胞因子产生的调控基因。根据CD4 T细胞内源性白细胞介素-2 (IL-2)或CD8 T细胞干扰素-(IFN-)的产生水平，用荧光进行分选。CRISPRi筛查也是如此。

Crispri筛查发现MALT1、BCL10等基因促进T细胞中细胞因子的表达，而CRISPRi筛查发现肿瘤坏死因子超家族受体4-1BB、CD27、CD40和OX40促进T细胞中细胞因子的表达，在发现T细胞中的细胞因子产生功能性调节基因方面具有互补性。

此外，研究团队还开发了一个结合CRISPRa和单细胞RNA测序的平台CRISPRa Perturb-seq，对全基因组筛选发现的70个功能性调控基因进行了深入的分子表征，揭示了细胞因子产生的调控基因是如何调控T细胞活化，将细胞编程为不同的刺激反应状态的。

总之，本研究开发了一个强大的研究平台，可用于大规模筛选人原代T细胞中的CRISPRa和CRISPRi，并成功筛选出能够在全基因组调控细胞因子产生的基因网络。结合单细胞RNA测序，对筛选到的基因进行了进一步表征。这些研究为下一代细胞治疗提供了新的靶点。

论文链接:

https://www.science.org/doi/10.1126/science.abj4008